Implication of extracellular vesicles in thrombosis associated with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria

Promoters

Prof. Jean-Michel DOGNE, UNamur, Department of Pharmacy (promoter)

Prof. Christian Chatelain, CHU UCL Namur, Hematology department (co-promoter)

Jury

Christian CHATELAIN, CHU UCL Namur ; Jean-Michel DOGNE, Promoteur, Faculté de Médecine ; Carlos GRAUX, Faculté de Médecine ; Philippe HAINAUT, Clinique Saint-Luc Woluwe Saint-Lambert ; Romaric LACROIX, Aix Marseille Université ; Bernard MASEREEL, Faculté de Médecine ; François MULLIER, Faculté de Médecine

Summary

(French version below)

Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is a rare, acquired disorder of the pluripotent hematopoietic stem cell due to an increased sensitivity toward attack of the complement, resulting in intravascular hemolysis. Venous and arterial thrombotic events are frequent and severe, making the disease challenging to treat. The exact pathophysiology of thrombosis in PNH is still unknown but probably multifactorial and extracellular vesicles (EVs) may play a central role. Other processes possibly involved include hemolysis, platelet activation, injured endothelial cells, leukocytes recruitment and activation, and dysregulation of fibrinolysis.

EVs are cellular fragments, limited by a membrane bilayer of phospholipids and released in plasma and other body fluids by hematopoietic, endothelial or cancer cells following activation or apoptosis. They have a complex structure and are heterogeneous in size (30 nm to 1 µm) and composition. Their characterization requires a combination of different methodologies, including flow cytometry, electron microscopy and functional assays (thrombin generation, phosphatidylserine and tissue factor dependent assays).

In previous studies, increased levels of circulating EVs have been measured in PNH patients, a majority of them coming from platelets (PEVs). PEVs are known in vitro to have a 50- to 100-fold higher procoagulant activity than activated platelets.

Eculizumab, a humanized monoclonal antibody blocking the activation of complement protein C5, has been shown to be effective in reducing thrombotic complications in PNH patients. The mechanisms involved remain misunderstood.

Because of hemolysis and some degree of bone marrow failure, PNH patients frequently need red blood cell (RBC) transfusion. Observations suggest that RBC transfusion is associated with increased thrombotic events. The release of procoagulant RBC EVs (REVs) during storage of packed RBC before transfusion may promote hemostasis and increase thrombotic risk in some patients already having a hypercoagulable state.

The first objective of this work was to assess the procoagulant activity of plasma isolated from PNH patients (treated or not by eculizumab) and to characterize their circulating EVs. In this prospective and comparative study, we observed a significant decrease of the number of PEVs after initiation of eculizumab therapy in PNH patients, along with a decrease of the phospholipid-dependent procoagulant potential of their plasma.

The second objective was to characterize REVs released in packed RBC for transfusion and their evolution during storage. We observed that REVs generated during storage have a phospholipid-dependent procoagulant activity. This second study highlighted simultaneously STA®-Procoag-PPL assay as a potentially useful technique to assess the procoagulant activity of RBC concentrates.

In conclusion, this work brings additional arguments about the potential role of EVs in pathophysiology of thrombosis in PNH and on the impact of eculizumab on this mechanism. The use of EVs as a biomarker of thrombotic risk, in PNH and in other prothrombotic conditions, deserves to be further studied. Furthermore, the STA®-Procoag-PPL assay could be interestingly used in future clinical studies aiming to assess the thrombotic risk of RBC transfusion.

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L’hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN) est une maladie rare, acquise, de la cellule souche hématopoïétique suite à une sensibilité accrue à l’attaque du complément, résultant en une hémolyse intravasculaire. Les évènements thrombotiques veineux et artériels sont fréquents et graves, rendant la maladie particulièrement difficile à traiter. La physiopathologie exacte des thromboses dans l’HPN est encore méconnue mais probablement multifactorielle et les vésicules extracellulaires (VEs) pourraient jouer un rôle central. D’autres processus possiblement impliqués comprennent l’hémolyse, l’activation plaquettaire, les cellules endothéliales lésées, le recrutement et l’activation des leucocytes et la dysrégulation de la fibrinolyse.

Les VEs sont des fragments cellulaires, limités par une double couche membranaire de phospholipides et libérés dans le plasma et dans d’autres fluides corporels par les cellules hématopoïétiques, endothéliales ou cancéreuses suite à leur activation ou leur apoptose. Elles ont une structure complexe et sont hétérogènes en taille (30 nm à 1 µm) et en composition. Leur caractérisation nécessite la combinaison de différentes méthodes, incluant la cytométrie en flux, la microscopie électronique et des tests fonctionnels (génération de thrombine, tests dépendants de la phosphatidylserine ou du facteur tissulaire).

Dans de précédentes études, des taux accrus de VEs ont été mesurés chez des patients HPN, la majorité d’entre elles étant d’origine plaquettaire (VEPs). Les VEPs sont connues in vitro pour avoir une activité procoagulante 50 à 100 fois plus élevée que les plaquettes activées.

L’eculizumab, un anticorps monoclonal humanisé bloquant l’activation de la protéine C5 du complément, a été démontrée comme efficace pour réduire les complications thrombotiques chez les patients HPN. Les mécanismes impliqués restent méconnus.

Suite à l’hémolyse et à un certain degré d’insuffisance médullaire, les patients HPN nécessitent fréquemment des transfusions de globules rouges (GR). Des observations suggèrent que les transfusions de GR sont associées à une augmentation des évènements thrombotiques. La libération de VEs procoagulantes d’origine érythrocytaire (VERs) durant le stockage des concentrés érythrocytaires avant transfusion pourrait promouvoir l’hémostase et augmenter le risque thrombotique chez certains patients qui présenteraient déjà un état hypercoagulable.

Le premier objectif de ce travail était d’évaluer l’activité procoagulante du plasma isolé de patients HPN (traités ou non par eculizumab) et de caractériser leurs VEs circulantes. Dans cette étude prospective et comparative, nous avons observé une diminution significative du nombre de VEPs après initiation du traitement par eculizumab chez des patients HPN, parallèlement à une diminution du potentiel procoagulant dépendant des phospholipides de leur plasma.

Le second objectif était de caractériser les VERs libérées dans les concentrés érythrocytaires destinés à la transfusion ainsi que leur évolution en cours de stockage. Nous avons observé que les VERs générées pendant le stockage ont une activité procoagulante dépendante des phospholipides. Cette seconde étude a simultanément mis en lumière le test STA®-Procoag-PPL, comme une technique potentiellement utile pour déterminer l’activité procoagulante des concentrés érythrocytaires.

En conclusion, ce travail apporte des arguments supplémentaires concernant le rôle potentiel des VEs dans la physiopathologie des thromboses dans l’HPN et l’impact de l’eculizumab sur ce mécanisme. L’utilisation des VEs comme biomarqueurs du risque thrombotique, dans l’HPN et dans d’autres situations prothrombotiques, mérite d’être étudié davantage. De plus, le test STA®-Procoag-PPL pourrait être utilisé de manière intéressante dans les futures études cliniques visant à évaluer le risque thrombotique des transfusions de GR.